| Técnicas
básicas |
La ingeniería
genética se sirve de un número limitado de técnicas
que combinadas producen los logros deseados.
Estas herramientas
de trabajo van mejorando y divesificándose con el tiempo
y sumándose continuamente nuevas técnicas.
Esta tecnología
está en continuo progreso y se producen constantes mejoras.
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Desnaturalización,
renaturalización e hibridación del ADN y ARN
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Se basa en la
capacidad de los ácidos nucleicos de aparearse espontáneamente
con otros ADN o ARN complementarios.
Puede haber híbridos
de la misma molécula ADN-ADN, ARN-ARN o de diferentes
ácidos nucleicos ADN-ARN
El apareamiento
se puede regular por cambios de temperatura: Altas temperaturas
se separan las hebras (desnaturalización)
y a bajas temperaturas se vuelven a hibridar (renaturalización)
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Pueden hibridar ácidos
nucleicos complementarios con eficiencia de 1/1.000.000
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Endonucleasas
de restricción
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Las endonucleasas
de restricción son enzimas que poseen las bacterias
para protegerse de genomas extraños.
Cortan el ADN
en una determinada secuencia generalmente palindrómica
de 4 a 8 bases :
Ej GAATTC
Este
proceso les sirve como defensa pues su ADN nunca posee estas
secuencias mientras que un ADN extraño, un virus,
si que puede tenerlo, en cuyo caso lo desactivan.
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En ingeniería
genética se utilizan para marcar puntos y reconstruir el
cromosoma de modos diferente.
Frecuentemente dan
lugar a secuencias con extemos libres que pueden volver a adherirse.
(Extremos adherentes)
Con una enzima reparadora del ADN pueden reconstruirse secuencias
aparedas
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Reacción
en cadena de la polimerasa. (PCR)
Consiste en la amplificación
de la cantidad de ADN de una misma secuencia
Se parte
de una disolución con ADN de doble cadena que se quiere
aplificar
Se añaden los cuatro tipos de dNTP y una ADN polimerasa
resistente al calor (procedente de una termobacteria)
Se calienta a 95ºC durante 15s: de esta manera se desnaturaliza
el ADN
Se enfría la disolución a 72ºC para que actúe
la polimerasa replicando el ADN
Se repite el proceso que actúa de forma exponencial.
En 20 ciclos se alplifica un millón de veces, en 30 ciclos
mil millones. Menos de una hora
Se pueden amplificar fragmentos de hasta 10 Kb
(en realidad el proceso es más complejos porque la ADNpol
necesita un cebador)
Incluyendo determinados
cebadores se consigue amplificar sólo un determinado tipo
de ADN. Por ejemplo para detectar la presencia de un determinado
virus o bacteria en una muestra
Video
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Cromatografía
y electroforesis
Son mecanismos de separación
de fragmentos de ácidos nucleicos por migración
en geles
En electroforesis se aplica una diferencia de potencial eléctrico
Pueden separar fragmentos de mezclas de hasta 20 Kb
Pueden diferenciarse fragmentos de 1000 pb
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Identificación
secuencial
Se trata de conocer
los nucleótidos concretos de los que está formado
un ácido nucleico.
Se parte de una disolución
de un ácido nucléico
Se marca un extremo mediante un producto radioactivo o fluorescente
Se aplican endonucleasas para cada base. Cortan el ácido
nucleico tras cada base.
Se realiza una electroforesis que separa el ácido nucléico
por tamaños.
Se identifican las bandas que corresponden a cada base.
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Identificación
por interrupción de la replicación
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Se toma una disolución
de un fragmento de ADN
Se introduce en cuatro tubos de ensayo, en cada uno de los
cuales hay los 4 dNTP y la ADN pol
En cada uno de ellos hay un nucleótido desoxi 2´3´
de cada base en escasa cantidad
Al introducir la polimerasa este nucleótido cesa
la trascripción
Se hace una electroforesis simultáneas de los cuatro
tubos
Las manchas de tamaños relativos indican la secuencia
Pueden secuenciarse hasta 500 bases
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Secuenciación
por electroforesis capilar
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Utilización
de la retrotranscriptasa ARN -> ADN
Formación de
ADN artificiales a partir de ARN
Se toma una disolución de ARN. Se añaden los 4 dNTP
y la Trascriptasa inversa de un virus.
Se forma ADN complementario al ARN original
Se suele aplicar a
ARNm eucariotas maduros en cuyo caso el ADN retrotrascrito no
posee intrones
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Mecanismos
para la introducción de genes en células
Es un proceso complejos
pues las células poseen mecanismos que impiden la entrada
de genes externos pues suele tratarse de virus u otros agentes
infecciosos.
Suele recurrisrse a la utilización de vectores.
Mecanismos de inclusión de un ADN en una célula
Plásmidos
Pueden trasmitirse entre bacterias por procesos parasexuales
Virus
Pueden incluirse genes en virus que penetren el la célula.
ADN desnudo
En determinadas circunstancias las células absorben ADN
del entorno
Microinyección
y microproyectiles
Consiste en fijar los genes a un pequeño fragmento de
un metal pesado e inyectarlo o inyectar el gen directamente
en la célula
En todos los casos
la eficiencia del método es escasa, pueden ser unos casos
entre miles o millones por lo que debe haber un proceso posterior
de identificación de las células transformadas.
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Fabricación
de ADN y ARN sintéticos.
Se fija un ADN o ARN
a una superficie
Se añade un nucleotido modificado de modo que solo se polimerice
una unidad
Se añade un producto que elimina la sustancia que impide
la polimerización
Se repite el proceso con una efentividad del 98%
La secuencia más larga es la que no ha fallado en ninguna
ocasión
Se pueden conseguir cadenas de hasta 100 nucleótidos
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Selección
de organismos trasformados
Para seleccionar los
organismos que han incorporado una secuencia genética de
interés se recurre a diversas técnicas que tienen
en común la detección de los organismos trasformados
y la eliminación de los no trasformados
En bacterias se recurre
al cultivo en placa que son capaces de crear colonias a partir
de un individuo
Se puede incluir juntos el gen útil con otro gen de resistencia
a antibióticos
Medio con antibiótico solo soblevivan las transgénicas
que queremos
Se puede hacer con otros genes que coloreen la colonia o que proporcionen
características nutricionales diferentes a la cepa normal.
En otros microorganismos
eucariotas como levaduras se pueden emplear mecanismos semejantes
aunque los genomas son más complejos
En animales y plantas
el mecanismo es considerablemente más complejo por las
tasas bajas de reproducción y tiempos más largos
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Tratamiento
informático de los datos
Los ácidos nucleicos
poseen secuencias muy monótonas con las que los humanos
nos es difícil trabajar
Los mecanísmos genéticos son capaces de ser reconocidos
y emulados por programas informáticos.
Son capaces de detectar el comienzo y final de genes, intrones,
secuencias conservadas en el genoma, genes fósiles....
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Regulación
de transcripción por ARN interferente
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Sistema CRISPR
Cas9
Gracias a un mecanismo
de defensa de las bacterias es posible cortar las dos cadenas
de un coromosoma en una secuencia específica.
La proteína Cas9 lleva un fragmento de ARN y busca su complementario
en el ADN. Cuando o encunetra lo corta.
El ARN que lleva se genera en el sistema CRISPR y corresponde
a secunecias de ADN de organismos parásitos
Esta técnica
se utiliza para:
Sistema
Crispr Cas bacteriano
Utilidad de
la Crispr cas9
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