El desarrollo de técnicas de ingeniería genética y la microbiología ha provocado un desarrollo extraordinario de la biotecnología actual.

Campos de la biotecnología actual

La biotecnología actual tiene aplicaciones muy diversas
A veces se les asigna colores a las ramas biotecnológicas:

Agricultura y ganadería - Biotecnología verde

• Bacterias que favorecen crecimiento de plantas
• Plantas trasgénicas resistentes a herbicidas, generen plaguicidas, produzcan más
• Animales trasgénicos más productivos; ganado, peces....
• Plaguicidas

Medicina - Biotecnología Roja

• Producción de fármacos por microorganismos
• Producción de fármacos por mamíferos
• Vacunas
• Antibióticos
• Anticuerpos monoclonales
• Activación sistema inmune
• Técnicas de diagnóstico
• Reparación dce tejidos y órganos por célular madre
• Terapias génicas

Investigación básica

• Sistemas modelo.
  • Organismos propensos a enfermedades humanas
  • Organoismos con fluorescencia ante determinados cambios

Industria y energía - Biotecnología Blanca

• Productos químicos fabricados por microorganismos: Etanol, hidrocarburos, toxina, antibióticos, hgormonas...
• Bacterias descontaminadoras
• Producción de biocombustibles: Metano, bioetanol, grasas
• Fijación CO2

Biotecnología gris: Medioambiental

• Conocimineto de genomas de seres vivos
• Caracterización de especies. Huella genética
• Identificación de especies

Biotecnología amarilla: Nutrición

• Más nutrientes en alimentos
• Desde antiguo Pan queso yagour cerveza vino

Bitecnología militar y contramilitar

• Armas biológicas
• Antídotos armasbiológicas
• Antivenenos

Las técnicas usadas en la biotecnología actual son muy variadas y de uso muy diverso
A continuación se enumeran algunas de las más importantes

Técnicas de ADN Recombinante

Permiten conocer y manipular secuencias génicas

El ADN es una molécula y aunque pueda ser muy larga siempre es muy pequeña (2 nm de diámetro).

Para conocer su secuencia o trabajar con él ha de amplificarse, es decir, tener muchas copias del mismo.

Otro problema es la longitud, puede tener varios centímetros por lo que es difícil de manipular. Se ha de reducir a fragmentos menores . Los ADN de los seres vivos tiene millones de pares de bases (humanos 6.000 millones)

Endonucleasas de restricción y ligasas

Enzimas que permiten trocear el ADN según una secuencia determinada y volver a unirlo.
Las endonucleasas de restricción son enzimas defensivas de bacterias que cortan el ADN por determinadas secuencia. En ocasiones son polindrómicas o cohesivos (se leen igual en ambas cadenas) lo que permite volver a unirlo.
Las ligasas unen ADN de doble cadena en la zona interrumpida

Estas técnicas se utilizan para:

- Obtener fragmentos de ADN manejables
- Ensamblar ADN diferentes

Electroforesis

Mecanismos que permiten separar el ADN, ARN, proteínas en un gel sometido a cargas eléctricas Las macromoléculas se separan dependiendo del tamaño (ácidos mucleicos) o de tamaño, carga y forma (proteínas) Esta técnica se utiliza para: - Separar fragmentos de ADN o ARN - Separar proteínas

Marcado de secuencias

Las moléculas de interén en biotecnología son transparentes.
Para localizarlas hay que visualizarlas. Las principales técnicas son:
- Marcado por productos radioactivos
- Marcadores fluorescentes

Esta técnica se utiliza para:

- Poder visualizart determinados ADN, ARN u otros compuestos celulares

Desnaturalización de ADN (o de híbridos ADN-ARN)

Un ADN de doble cadena se encuentra enrrollado en espiral. Si se le calienta a temperaturas próximas a los 100ºC las dos hebras se separan. A este proceso se le denomina desnaturalización del ADN.

Hibridación o renaturalización

Propiedad de los ácidos nucleicos de unirse con los de la misma secuencia.
Se calienta para separar las hebras. se deja enfriar lentamente y se unen hebras complementarias

Reacción en cadena de la polimerasa

Consiste en la amplificación de la cantidad de ADN de una misma secuencia

Esta técnica se utiliza para:

- Amplificar secuencias genéticas

Se parte de una disolución con ADN de doble cadena que se quiere aplificar, los 4dNTP, DNA pol resistente al calor (de una termobacteria) Se calienta a 95ºC durante 15s: se desnaturaliza el ADN Se enfría la disolución a 72ºC para que actúe la polimerasa replicando el ADN Se repite el proceso que actúa de forma exponencial. En 20 ciclos se alplifica un millón de veces, en 30 ciclos mil millones. Menos de una hora Se pueden amplificar fragmentos de hasta 10Kb (en realidad el proceso es más complejos porque la ADNpol necesita un cebador)

 

Secuenciación

Mecanismos que permiten conocer la secuencia de una cadena de ADN o ARN

Identificación secuencial

Se parte de una disolución con suficiente cantidad de un ácido nucléico
Se marca un extremo mediante un producto radioactivo o fluorescente
Se aplican endonucleasas para cada base. Cortan el ácido nucleico tras cada base.
Se realiza una electroforesis que separa el ácido nucléico por tamaños.
Se identifican las bandas que corresponden a cada base.

Identificación por interrupción de la replicación

Se toma suficiente cantidad de una disolución de un fragmento de ADN
Se introduce en cuatro tubos de ensayo, en cada uno de los cuales hay los 4 dNTP y la ADN pol
En cada uno de ellos hay un nucleótido desoxi 2´3´ de cada base en escasa cantidad
Al introducir la polimerasa este nucleótido cesa la trascripción
Se hace una electroforesis simultáneas de los cuatro tubos
Las manchas de tamaños relativos indican la secuencia
Pueden secuenciarse hasta 500 bases

Trascriptasa inversa

Formación de ADN artificiales a partir de ARN
Se toma una dislución de ARN. Se añaden los 4 dNTP y la Trascriptasa inversa de un virus.
Se forma ADN complementario al ARN original
Se suele aplicar a ARNm eucariotas maduros en cuyo caso el ADN retrotrascrito no posee intrones

Sistema CRISPR Cas9

Gracias a un mecanismo de defensa de las bacterias es posible cortar las dos cadenas de un coromosoma en una secuencia específica.
La proteína Cas9 lleva un fragmento de ARN y busca su complementario en el ADN. Cuando o encunetra lo corta.
El ARN que lleva se genera en el sistema CRISPR y corresponde a secunecias de ADN de organismos parásitos

Esta técnica se utiliza para:

- Edición genética precisa

 

Técnicas de Ingeniería genética

Técnicas que permiten la manipulación de los genes
Localizar cambiar de sitio y modificar genes

Vectores : Virus, plásmidos

Es un proceso complejos pues las células poseen mecanismos que impiden la entrada de genes externos pues suele tratarse de virus u otros agentes infecciosos.
Suele recurrisrse a la utilización de vectores.
Mecanismos de inclusión de un ADN en una célula

Plásmidos
Pueden trasmitirse entre bacterias por procesos parasexuales

Virus
Pueden incluirse genes en virus que penetren el la célula.

ADN desnudo
En determinadas circunstancias las células absorben ADN del entorno

Microinyección y microproyectiles
Consiste en fijar los genes a un pequeño fragmento de un metal pesado e inyectarlo o inyectar el gen directamente en la célula

Transformar células u organismos

Si los organismos en los que se ha introducido la información la incorporan a su genoma se habla de organismos transformados. Expresan nuevos genes o de manera diferente los propios.

Como la eficiencia de los vectores es pobre y la incorporación al genoma es poco probable, la eficiencia del método es muy escasa, pueden ser unos casos entre miles o millones por lo que debe haber un proceso posterior de identificación de las células transformadas.

Marcaje y selección

Los organismos o células han de poder ser identificados y separados de los que no loo han sido

Existen varias posibilidades de marcado
Lo más frecuente es incluir otros genes fáciles de detectar

- Genes de resistencia a antibióticos
- Genes que produzcan sustancias coloreadas o fluorescentes

 

Cultivos celulares y de tejidos

Para la bioingeniería es fundamental disponer de células de las que extraer o incluir material genético o experimentar efectos.

Existen técnicas de cultivos de células que permiten controlarlas y manipularlas.
los más importantes son:

Cultivos bacterianos

Muy utilizado en microbiología. Se prepara un medio se pone un inóculo y se espera a que crezca
Permite un crecimiento rápido de células y la separación de cepas o bacterias modificadas

Cultivos en levaduras

Algo más complicado que las bacterias pero se utiliza por ser organismos eucariotas más semejantes a humanos

Cultivos celulares animales

Se pueden cultivar tejidos o celulas aisladas.
Existen líneas celulares inmortales con determinadas caractyerísticas que permiten la investigación
Hay problemas éticos con las células embrionarias

Cultivos celulares de plantas

Meristemos de plantas pueden cultivarse y evitar su diferenciación

 

Cultivos celulares animales

Diferenciación celular

Consiste en intervenir en el proceso de diferenciación celular para crear detreminados tipos celulares

Selección células embrionarias y células madre

Las células madre son capaces de diferenciarse en otros tipos celulares. Las ya diferenciadas no.

Se llaman Totipotentes las que pueden dar cualquier tipo celular.
Son células embrionarias hasta el blastocito

Se llamamn Pluripotentes a las células madre de un tipo de tejido. Pueden dar células de ese tejido pero no de otros
Son células de determinadas capas del embrión además de algunas del cordón umbilical, líqido amniótico y otros tejidos

Se llamamn Unipotentes a las células madre de un tipo de célula. Se conocen unos 20 tipos en humanos y se encargan de sustituir a células diferenciadas cuando mueren.

En biotecnología se necesitan muchas veces células madre con la máxima potencialidad posible y los embriones humanos presentan problemas éticos para su utilización científica o terapreútica

Reversión de la diferenciación celular

Múltiples líneas de investigación pretenden la reversión de células diferenciadas

Sería un logro muy importante al no depender de cálulas embrionarias

Transplante de núcleos

Con micropipetas se extraen núcleos de una célula y se introducen en otra.
Permite meter un núcleo en un ambiente diferente, el citoplásmico, para que se reprograme.

Con un óvulo en el que se introduzca un nucleo de una célula somática es posible inducir la clonación.
Se ha hecho en varias especies incluida la humana (como clonación terapeútica, sin que llegue a termino,que se sepa)